Pyrosekvenovanie
Pyrosekvenovanie patrí medzi najmodernejšie prístupy sekvenovania. Je to kvantitatívna sekvenačná metóda, ktorá umožňuje nielen získanie DNA sekvencie pomocou real-time sekvenovania počas syntézy DNA, ale aj kvantitatívne vyhodnotenie výsledkov. Princíp je založený na luminometrickej detekcii pyrofosfátu (PPi), ktorý je uvoľňovaný pri polymerizácii DNA.
Samotnému pyrosekvenovaniu predchádza príprava vzoriek. Vyizolovanú DNA je potrebné modifikovať bisulfidom sodným. Modifikovaná DNA je amplifikovaná polymerázovou reťazovou reakciou (PCR), kde je jeden z dvoch primerov značený na 5´ konci biotínom, výsledkom čoho, sú biotinylované PCR produkty. Biotín zabezpečí imobilizáciu PCR produktu na streptavidín-sefarózové guličky počas prípravy templátu na sekvenovanie. Nakoniec sa PCR produkty prečistia, denaturujú a po ochladení pri izbovej teplote je príprava vzoriek pre pyrosekvenovanie ukončená.
Princíp pyrosekvenovania:
Pri pyrosekvenovaní hrajú kľúčovú úlohu 4 dôležité enzýmy:
- DNA polymeráza
- ATP sulforyláza
- Luciferáza
- Apyráza
Reakčná zmes musí okrem spomenutých enzýmov obsahovať aj enzýmové substráty – adenozín-fosfosulfát (APS), luciferín, ako aj templát (PCR produkt) a sekvenačný primer.
Prvým krokom pyrosekvenovania je pridanie jedného zo 4 nukleotidov (dATPαS, dTTP, dCTP, dGTP) do reakcie. Ak je pridaný nukleotid komplementárny k báze v templátovom vlákne, DNA polymeráza katalyzuje jeho zabudovanie do vlákna. Zabudovanie nukleotidu je sprevádzané uvoľnením pyrofosfátu (PPi) v kvantite equimolárnej k množstvu inkorporovaného nukleotidu. Uvoľnený pyrofosfát indukuje druhú reakciu a je v prítomnosti adenozín-5’-fosfosulfátu konvertovaný ATP-sulfurylázou na ATP. Energiu vo forme ATP využije luciferáza na konverziu luciferínu na oxyluciferín, čo je sprevádzané vyžiarením viditeľného svetla, ktoré je úmerné k množstvu ATP. Svetlo je detegované CCD kamerou (charge coupled device), kvantifikované a znázornené v pyrograme v podobe píkov rôznej výšky v závislosti od množstva snímaného svetla.
V poslednom kroku sú nezabudované nukleotidy degradované apyrázou, keď je degradácia kompletná, do reakcie je pridaný ďalší typ dNTP.
Pyrosekvenovanie umožňuje optimálne kvantitatívne vyhodnotenie metylácie každého
CpG dinukleotidu v analyzovanej sekvencii, čo je značným prínosom pre posúdenie
významu stupňa metylácie špecifických génov v nádorovom procese
QM - MSP
Metóda kvantitatívnej multiplexnej metylačne špecifickej PCR (QM-MSP) je založená na real-time technológii. V prvom kroku tejto reakcie uskutočňujeme multiplexnú ko-amplifikáciu dvoch alebo viacerých génov v jednej PCR reakcii, čo je výhodné z časového aj finančného hľadiska. Primery na multiplexnú reakciu sú navrhnuté tak, aby komplementárne sekvencie pre primery neobsahovali CpG dinukleotidy, teda aby sa amplifikovali potrebné úseky DNA bez ohľadu na metylačný status templátu. Produkty prvej reakcie overujeme pomocou agarózovej elektroforézy. Ak je to potrebné, produkty riedime tak, aby vstupné množstvo DNA do ďašej reakcie neprevyšovalo 6 ng.
V druhom kroku uskutočňujeme real-time PCR pre každý gén separátne (CFX96TM Real-Time PCR system Bio-Rad, USA). Pri real-time reakcii môžeme v reálnom čase na obrazovke počítača sledovať zvyšovanie množstva amplifikovanej DNA. Táto detekcia je založená na monitorovaní a kvantifikácii flourescencie TaqMan prób. TaqMan próby sú hydrolyzačné próby značená dvomi značkami – reportérový fluorofor a quencher. Využívajú 5´nukleázovú aktivitu Taq polymerázy. Próby, ktoré hybridizovali ku komplementárnej sekvencii v DNA, dokáže polymeráza využitím tejto aktivity poštiepiť a pritom dochádza k uvoľneniu fluorescenčného signálu (Obr. č. 1).
(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/0/07/Taqman.png)
V real-time PCR používame dve sady primerov a dva typy TaqMan prób, ktoré boli navrhnuté tak, aby boli komplementárne buď, k metylovanému alebo k nemetylovanému substrátu. Každá vzorka je potom trojmo analyzovaná v 96 jamkovej platničke v real-time cykleri. Vzorky v QM-MSP reakcii vyhodnocujeme na základe štandardnej krivky. Príklad výsledkov real-time PCR komerčných metylovaných a nemetylovaných substrátov a z nich zostrojenej štandardnej krivky je znázornený na obrázku č. 2 a 3.
Výsledok QM-MSP reakcie, kde templátom boli produkty prvej PCR reakcie univerzálne metylovanej a nemetylovanej DNA so známou koncentráciou zmiešané v pomeremere 1:1 a a séria šiestich riedení, na základe ktorých vznikne štandardná krivka
Štandardná krivka, na základe ktorej sú vyhodnocované analyzované vzorky.
Percento metylácie jednotlivých vzoriek pre každý gén potom vypočítame na základe vzorca [M/(U+M)] ×100, použitím štandardnej krivky. U je množstvo nemetylovaného substrátu v bode treshold-u a M je množstvo metylovaného substrátu v bode treshold-u. Treshold predstavuje hranicu citlivosti použitej metodiky, prahový cyklus, v ktorom signifikantné zvýšenie intenzity signálu substrátu je už prístroj schopný zaznamenať a prevyšuje intenzitu fluorescenčného pozadia.
Uvedená metóda QM-MSP umožňuje kvantitatívne vyhodnotenie metylácie v študovaných génoch zodpovedných za reguláciu rastu, invazivitu a metastázovanie, čo môže prispieť k objasneniu procesu tumorigenézy karcinómu prsníka.